Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung eines endogenen 5-Lipoxygenase-Inhibitors aus Mono-Mac-6-Zellen

Dietlind Straif befaßt sich in dieser Arbeit mit der Isolierung, der Identifizierung und der Charakterisierung eines endogenen Inhibitors der 5Lipoxygenase aus Mono-Mac-6Zellen. Die wichtigsten Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: - Die Isolierung des endogenen Inhibitors aus dem 100.000g-Überstand undifferenzierter MM6Zellen erfolgte in vier Schritten. Nach einer Gelpermeationschromatographie an Sephacryl S- 200 wurden die aufkonzentrierten, aktiven Fraktionen über einen schwachen Anionenaustauscher (Fractogel π EMD DEAE- 650 TentakelSäule, Merck) weiter aufgetrennt. Anschließend erfolgte die Isolierung der hemmenden DEAE- Fraktionen über eine PhenylSuperose-FPLC-Säule (RESOURCE TM PHE, Pharmacia). Sie stellte den effektivsten Schritt der Reinigung dar. Die weitere Aufreinigung der Pheny-SuperoseFraktionen wurde mit einer zweiten HIC- chromatographischen Trennung, einer IsopropylSuperose- FPLCSäule (RESOURCE TM ISO, Pharmacia), durchgeführt. Die Reihenfolge der Säulen wurde so gewählt, daß ein Pufferaustausch und eine Aufkonzentrierung großer Fraktionsvolumina nur jeweils einmal notwendig war. - Die Identifizierung des Proteins erfolgte mittels Western Blot, MALDITOFMassenspektroskopie und der Bestimmung eines Teils der Aminosäuresequenz. Ein polyklonaler Antikörper gegen die humane GlutathionPeroxidase (GPx1) und die Katalase wurde im Western Blot an das gereinigte Protein gebunden. Bei der SDSPAGE-Analyse wies das Protein eine der humanen GPx1 vergleichbare Größe auf. Das Monomer der humanen GPx1 erschien im SDSPAGE als Doppelbande, wobei eine Bande wahrscheinlich eine GPxForm darstellt, die durch aminoterminale Prozessierung entstanden ist. Die mittels MALDITOF bestimmten Massen des isolierten Enzyms entsprachen den berechneten Molekulargewichten des Monomers der humanen GPx1 sowie der prozessierten Form. Das Nterminale Ende des Inhibitors ist für den EdmanAbbau blockiert, nach einem "InGel-TrypsinVerdau" konnten aus einem Fragment 6 Aminosäuren bestimmt und der humanen GPx zugeordnet werden. Damit konnte das gesuchte Protein als die humane GlutathionPeroxidase1 identifiziert werden.